Die Vitamine D2 und D3 ☀️☀️haben sich überlappende, aber unterschiedliche Auswirkungen auf das menschliche Immunsystem, die durch die Analyse des Bluttranskriptoms aufgedeckt werden
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8908317/
Die Vitamine D2 und D3 haben sich überlappende, aber unterschiedliche Auswirkungen auf das menschliche Immunsystem, die durch die Analyse des Bluttranskriptoms aufgedeckt werden
1 , 2 , * , †Zusammenfassung
Vitamin D ist am besten bekannt für seine Rolle bei der Erhaltung der Knochengesundheit und der Calciumhomöostase. Es übt jedoch auch eine breite Palette von extraskelettalen Auswirkungen auf die Zellphysiologie und das Immunsystem aus. Die Vitamine D2 und D3 teilen ein hohes Maß an struktureller Ähnlichkeit. Die funktionelle Äquivalenz in ihren Vitamin-D-abhängigen Wirkungen auf die menschliche Physiologie wird normalerweise angenommen, wurde aber in der Tat experimentell nicht gut definiert. In dieser Studie versuchen wir, die Wissenslücke zu schließen, indem wir eine eingehende Untersuchung der Veränderungen im menschlichen Bluttranskriptom nach der Supplementierung mit physiologischen Dosen von Vitamin D2 und D3 durchführen. Unsere Arbeit erweitert eine zuvor veröffentlichte randomisierte placebokontrollierte Studie, in der gesunde weiße europäische und südasiatische Frauen rekrutiert wurden, die im Winter in Großbritannien (Nov-Mär) täglich über 12 Wochen 15 µg Vitamin D2 oder D3 erhielten, indem sie zusätzlich Veränderungen im Bluttranskriptom über den Interventionszeitraum mit Microarrays bestimmten. Ein integrierter Vergleich der Ergebnisse definiert sowohl die Wirkung von Vitamin D3 oder D2 auf die Genexpression als auch den Einfluss des ethnischen Hintergrunds. Ein wichtiger Aspekt dieser Analyse war der Fokus auf die Veränderungen der Expression von der Ausgangslinie bis zum 12-wöchigen Endpunkt der Behandlung innerhalb jedes Einzelnen, wobei das Längsschnittdesign der Studie genutzt wurde. Während eine Überschneidung im Repertoire von differenziell exprimierten Genen in den identifizierten D2- oder D3-abhängigen Wirkungen vorhanden war, waren die meisten Veränderungen spezifisch für das eine oder andere Vitamin. Die Daten wiesen auch auf die Möglichkeit ethnischer Unterschiede in den Antworten hin. Insbesondere nach der Vitamin-D3-Supplementierung spiegelten die meisten Veränderungen in der Genexpression eine Abwärtsregulierung der Aktivität von Genen wider, viele kodierende Wege des angeborenen und adaptiven Immunsystems, wodurch das Immunsystem möglicherweise in einen tolerogenen Status verlagert wird. Überraschenderweise unterschied sich die Genexpression im Zusammenhang mit der Typ-I- und Typ-II-Interferon-Aktivität, die für die angeborene Reaktion auf bakterielle und virale Infektionen entscheidend ist, nach der Supplementierung entweder mit Vitamin D2 oder Vitamin D3, wobei nur Vitamin D3eine stimulierende Wirkung hatte. Diese Studie legt nahe, dass eine weitere Untersuchung der jeweiligen physiologischen Rolle von Vitamin D2 und Vitamin D3gerechtfertigt ist.
Einführung
Vitamin D ist ein Pro-Hormon, das für die menschliche Gesundheit unerlässlich ist. Während Vitamin D am besten für seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Knochengesundheit und der Kalziumhomöostase bekannt ist, übt es auch eine breite Palette von extraskelettalen Auswirkungen auf die Zellphysiologie und das Immunsystem aus (1–6) und mehrere Studien haben einen schlechten Vitamin-D-Status mit einem erhöhten Risiko für osteoporotische und Stressfrakturen, einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einigen Krebsarten, einer schlechten Modulation des Immunsystems, einer höheren Mortalität einschließlich des Todes durch Krebs und der Pathogenese von immunvermittelten entzündlichen Erkrankungen (7–10). Es wird empfohlen, dass Einzelpersonen die Serumkonzentration von 25-Hydroxyvitamin D (25(OH)D) (der akzeptierte Biomarker des systemischen Vitamin-D-Status) von mindestens 25 nmol/L das ganze Jahr über und während des gesamten Lebens beibehalten (11). Vitamin-D-Mangel und Unzulänglichkeit (definiert als Serumkonzentrationen von 25(OH)D unter 25 nmol/L bzw. 50 nmol/L) gelten jedoch als globale Pandemie und ein Problem der öffentlichen Gesundheit von großer Bedeutung in der menschlichen Bevölkerung, insbesondere bei älteren Menschen, Personen, die nicht ausreichend Sonnenlicht ausgesetzt sind, und, was vor allem ethnischen Gruppen mit dunklerem Hautton (12–14).
Vitamin D ist der Überbegriff, der sowohl Vitamin D2 (Ergocalciferol) als auch Vitamin D3 (Cholecalciferol) bezeichnet. Sowohl das pflanzliche/pilzhaltige Vitamin D2 als auch die tierischen Vitamin-D3-Formen können in einigen (wenn auch begrenzten) menschlichen Lebensmitteln gefunden werden oder sind als Nahrungsergänzungsmittel erhältlich. Vitamin D3 wird jedoch auch in der Haut durch die Wirkung von ultravioletter B-Strahlung der Sonne produziert. Nach zwei aufeinanderfolgenden Hydroxylierungsschritten bindet in der Leber bzw. in der Niere die aktive Form des Vitamins 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)D3) an den intrazellulären Vitamin-D-Rezeptor (VDR) und im Komplex mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR) reguliert das Heterodimer die Expression von Hunderten von Genen durch das Vitamin-D-Reaktionselement (VDRE) (15); andere Gewebe exprimieren auch die 25(OH)D 1-α-Hydroxylase, obwohl die Niere als die wichtigste für die Produktion von zirkulierendem 1,25(OH)D (16). Beide Formen von Vitamin D können doppelt zu ihren aktiven Metaboliten hydroxyliert werden und binden mit ähnlicher Affinität an den VDR (17), aber es gibt nach wie vor einige Kontroversen darüber, ob sie identische biologische Reaktionen hervorrufen oder nicht (17–19). Darüber hinaus gibt es Unterschiede in ihrer Katabolik und in ihrer Bindungsaffinität zu Vitamin-D-bindendem Protein (DBP), dem wichtigsten Vitamin-D-Transportprotein im Blut. Vitamin D2 bindet DBP mit geringerer Affinität und wird schneller katatalisiert (20,21).
Die funktionelle Äquivalenz oder anderweitig von Vitaminen D2 und D3 für die menschliche Gesundheit war in den letzten Jahren Gegenstand vieler Debatten, wobei einige Autoren darauf hindeuten, dass die beiden Verbindungen die gleiche Wirksamkeit haben, während andere Beweise dafür liefern, dass Vitamin D3 die zirkulierende Serumkonzentration von 25(OH)D effizienter erhöht als Vitamin D2 (22–26). In akuten Studien, in denen die Wirksamkeit von Vitaminen D2 und D3 bei der Erhöhung der Serumkonzentration von 25(OH)D verglichen wird, ist Vitamin D2weniger wirksam als D3, wenn es als Einzelbolus verabreicht wird (22). Die Ergebnisse von Studien nach der täglichen Verabreichung von D2 oder D3 über längere Zeiträume sind jedoch mehrdeutig, wobei klinische Studien eine höhere Wirksamkeit von D3zeigen (27,28) oder gleiche Wirksamkeit (29,30). Darüber hinaus ergab eine kürzlich durchgeführte Metaanalyse von Vitamin-D-Supplementierungsstudien, dass eine reduzierte Krebssterblichkeit nur mit der Vitamin-D3-Supplementierung, nicht mit der Vitamin-D2-Supplementierung, beobachtet wurde, und wies darauf hin, dass die Gesamtmortalität in Studien mit Vitamin-D3-Supplementierung signifikant niedriger war als in Studien mit Vitamin D2 (9). Darüber hinaus macht eine kürzlich durchgeführte Studie mit US-Frauen die faszinierende Beobachtung, dass die beiden unabhängigen Metaboliten, 25(OH)D3 und 25(OH)D2, völlig unterschiedliche Assoziationen mit Depressionen zu haben scheinen (31). Die Ergänzung mit einer Form von Vitamin D kann die zirkulierenden Konzentrationen der anderen Form reduzieren. Zum Beispiel ergab unsere jüngste Vergleichsstudie von Vitamin D2 im Vergleich zu D3, dass die Serumkonzentration von 25(OH)D3 über die 12-wöchige Intervention bei Teilnehmern, die Vitamin D2 erhielten, reduziert wurde, verglichen mit der durchschnittlichen 12-wöchigen Konzentration bei Teilnehmern, die Placebo erhielten [(28), sieheAbbildung 1C, zum Beispiel]. Die Auswirkungen einer solchen gegenseitigen Erschöpfung sind noch zu untersuchen.
(A) Auswahl von 98 Probanden aus der Studie Tripkovic et al. (2017) (28) für die transkriptomische Analyse ihrer V1 (Auswerts-) und V3 (12-Wochen) Proben in der vorliegenden Studie; (B) Ethnizun und Behandlungsgruppenmitgliedschaft für die 97 Probanden, für die transkranskriptomische Daten erhalten wurden (Daten für ein südasiatisches Subjekt aus der Placebogruppe haben die Qualitätskontrolle nicht bestanden); (C) Metadaten zu Serumkonzentrationen von 25(OH)D2, 25(OH)D3, insgesamt 25(OH)D, PTH und Kalzium (Albumin-angepasst) für die 97 Probanden (siehe Zusatzdatendatei 1 für Details). Die Teilnehmer wurden ausgewählt, um vergleichbare Zahlen zwischen dem Placebo und den beiden Vitamin-D-Behandlungsgruppen anzugeben, die das gesamte Spektrum der Serumreaktionen auf die Supplementierung innerhalb der D2- und D3-Behandlungsgruppen abdecken, gemessen anhand der gemessenen Veränderungen der Serum-25(OH)D2- oder 25(OH)D3-Konzentrationen zwischen V1 und V3.
Aufgrund der Vielfalt der verwendeten experimentellen Designs gibt es ein begrenztes Verständnis für die Auswirkungen der Vitamin-D-Supplementierung auf die Genexpression in vivo beim Menschen. Dazu gehören: (i) verschiedene Probenahmeintervalle, die von Stunden bis Jahren nach der Vitamin-D-Supplementierung reichen (32,33); (ii) Verwendung von im Wesentlichen unterschiedlichen Dosen, die von physiologischen (mäßigen) bis supraphysiologischen Dosen reichen; und (iii) relativ kleine Teilnehmerzahlen, so dass die meisten Studien erheblich unterfordert waren (33,34). Derzeit gibt es keine soliden Beweise aus der In-vivo-Analyse der humanen Genom-weiten Expression, welche spezifischen zellulären Wege von der Vitamin-D-Supplementierung beeinflusst werden. Darüber hinaus wurde der Einfluss von Vitamin D2 im Gegensatz zu Vitamin D3 auf die Genexpression beim Menschen noch nicht untersucht, obwohl Vitamin D2 auch häufig als Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittelstärker verwendet wird.
Wir haben diese Wissenslücke behoben, indem wir die Genexpression in einer relativ großen Kohorte gesunder weißer europäischer und südasiatischer Frauen untersucht haben, die an einer randomisierten, doppelblinden, placebokontrollierten Studie - der D2-D3-Studie - teilnahmen, in der die relative Wirksamkeit der Vitamine D2 und D3bei der Erhöhung der Serumkonzentration von 25(OH)D verglichen wurde. Die Studie kam zu dem Schluss, dass Vitamin D3 bei der Erhöhung der Serumkonzentration von 25(OH)D besser als Vitamin D2 war (28). Als integraler Bestandteil des ursprünglichen Studiendesigns haben wir auch die Genexpression bei den Teilnehmern während des 12-wöchigen Versuchszeitraums untersucht. Dies ermöglichte es uns, die Auswirkungen der Vitamin-D-Supplementierung auf das Transkriptom zu untersuchen und festzustellen, ob sich diese Effekte nach der Supplementierung mit Vitamin D2 im Vergleich zu Vitamin D3 unterscheiden könnten. Wir liefern Beweise für die Hypothese, dass sich die biologischen Wirkungen von Vitamin D2 und D3 beim Menschen unterscheiden. Folglich ist eine umfassendere Analyse der biologischen Auswirkungen der beiden Formen von Vitamin D auf die menschliche Physiologie gerechtfertigt.
Materialien und Methoden
Die Rekrutierung von Personen im Rahmen der "D2-D3-Studie" wurde zuvor beschrieben (28) und die klinische Studie wurde registriert (ISRCTN23421591). Diese Studie erhielt ethische Genehmigung des National Health Service Research Ethics Committee der Südostküste (Surrey (11/LO/0708) und des Ethikausschusses der University of Surrey (EC/2011/97/FHMS). Alle Teilnehmer gaben vor Beginn der Studienaktivitäten eine schriftliche Einwilligung in Übereinstimmung mit der Helsinki-Erklärung. Kurz gesagt, 335 Frauen südasiatischer (SA) und weißer europäischer (WE) Abstammung wurden 12 Wochen lang in eine von drei Interventionsgruppen randomisiert und mit täglichen Dosen von Vitamin D in angereicherten Lebensmitteln (sowohl Orangensaft als auch Kekse) versorgt (28). Die Teilnehmer wurden randomisiert auf Placebo, 15 μg/d Vitamin D2 oder 15 μg/d Vitamin D3. Von den 335 Teilnehmern, die zuvor von Tripkovic et al (28) gemeldet wurden, wurden 97 für die Transkriptomanalyse ausgewählt, was 67 WE- und 30 SA-Teilnehmern entspricht; Zuweisungen für jede Behandlungsgruppe werden inAbbildung 1und ergänzende Datendatei 1. Die Teilnehmer wurden nach dem Zufallsprinzip aus beiden ethnischen Gruppen ausgewählt, um eine ausgewogene Placebo-Gruppe zu bilden. Wir führten eine Transkriptomanalyse zu Beginn (V1) und 12 Wochen nach Beginn der Behandlung (V3) durch.
Bluttranskriptom-Analyse
Volles peripheres Blut (2,5 ml) wurde mit PAXgen-Blut-RNA-Röhrchen (BD Biosciences and Diagnostics) gesammelt. Die Röhrchen wurden unmittelbar nach der Blutentnahme zehnmal invertiert, aufrecht bei 15-25°C für 24 Stunden gelagert, gefolgt von einem -20°C-Gefrierschrank für 24 Stunden und dann in einen -80°C-Gefrierschrank für die Langzeitlagerung. Die transcriptomische Analyse wurde im Wesentlichen wie in früheren Studien beschrieben durchgeführt (35, 36). Die Gesamt-RNA wurde mit dem PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers isoliert. cRNA wurde synthetisiert und fluoreszierend mit Cy3-CTP aus 200 ng Gesamt-RNA mit dem Low Input QuickAmp Labelling Kit, One Color (Agilent Technology) synthetisiert und fluoreszierend markiert. Die beschriftete cRNA wurde auf einem Sure Print G3 Human Gene Expression 8 x 60K v2 Microarray-Dia (Agilent Technologies) hybridisiert. Die Standardanweisungen des Herstellers für eine Farb-Genexpressionsanalyse wurden für die Kennzeichnungs-, Hybridisierungs- und Waschschritte befolgt. Die extrahierte RNA wurde mit dem NanoDrop ND2000 Spektrophotometer (Thermo Scientific) quantifiziert. RNA-Qualität und -Integität wurden entweder mit dem Bioanalyzer 2100 oder der TapeStation 4200 (Agilent Technologies) bewertet. Nur RNA-Proben mit einer RNA-Integritätszahl (RIN) von >7.0 wurden einer DNA-Microarray-Analyse unterzogen. Microarrays wurden bei 65°C für 17 Stunden in einem Agilent-Hybridisierungsofen auf einer Rotisserie bei 10 U/min hybridisiert. Die gewaschenen Microarrays wurden mit einem Agilent Microarray Scanner mit einer Auflösung von 2 μm gescannt.
Transkriptom-Datenverarbeitung und Differentialexpressionsanalyse
Rohe gescannte Microarray-Bilder wurden mit der Agilent Feature Extraction-Software (v11.5.1.1) mit dem Agilent 039494_D_F_20140326_human_8x60K_v2-Raster verarbeitet und dann zur Normalisierung und Analyse mit dem LIMMA-Paket in R importiert (37). Normalisierte Daten für alle Teilnehmer (V3 - V1) wurden durch die Hauptkomponentenanalyse bewertet, um auf Batch-Effekte zu prüfen (Zusätzliche Abbildung 3). Microarray-Daten wurden mit der "normexp"-Methode (mit einem Offset von 50) im Hintergrund korrigiert und Quantil normalisiert, wodurch Expressionswerte in der Log-Base-2-Skala erzeugt wurden. Die verarbeiteten Daten wurden dann gefiltert, um Sonden zu entfernen, die niedrige Signale über die Arrays hinweg aufweisen, wobei Nicht-Kontrollsonden beibehalten wurden, die mindestens 10 % heller sind als negative Kontrollsondensignale in mindestens 41 Arrays (~20% der Arrays in der Analyse). Daten von identischen Replikationssonden wurden dann gemittelt, um Ausdruckswerte auf der eindeutigen Sondenebene zu erzeugen. Die anfängliche Datenexploration identifizierte eine Stichprobe (Teilnehmer 0017, V3-Zeitpunkt) mit Array-Daten, die ein bemerkenswerter Ausreißer aus der Gruppe waren, und daher wurden sowohl die V1- als auch die V3-Mikroarrays für dieses Thema von allen nachfolgenden Analysen ausgeschlossen, wobei die Daten wie oben in ihrer Abwesenheit vor dem Fortfahren wiederverarbeitet wurden.
Tests für die differenzielle Expression wurden mit LIMMA durchgeführt, wobei geeignete lineare Modelldesigns angewendet wurden, um zu identifizieren: (i) signifikante Unterschiede in den Transkriptionsantworten, die während des 12-wöchigen V1- bis V3-Zeitraums der Studie zwischen den Behandlungs- und Placebogruppen für jede ethnische Kohorte auftreten (Beispielkontraste getestet, im Format ethnicity_treatment_time: (WE_D2_V3 - WE_D2_V1) - (WE_P_V3-WE_V3_WE_P_V1) = 0, und (WE_D3_V3 - WE_D3_V1) - (WE_P_V3 - WE_V3 - WE_P_V1) = 0); und ii) um signifikante Veränderungen für jede ethnische Kohorte innerhalb jeder Behandlungsgruppe zwischen den V3- und V1-Stichprobenpunkten zu bestimmen, wobei die WE_D3_V3 - WE_D3_V1 = 0). Die Blockierung der Subjektidentität wurde verwendet, um die Variabilität zwischen den Subjekten zu kontrollieren. Signifikanz-p-Werte wurden mit der Benjamini- und Hochberg-Methode für die Vielfachigkeit korrigiert, wobei angepasste p-Werte (adj.P.Val) erhalten wurden.
Funktionale Bereicherung und Netzwerkanalyse
Die funktionale Anreicherungsanalyse von Listen von Genen von Interesse mit gültigen ENTREZ-Genidentifikatoren wurde mit dem R-PaketclusterProfiler (38) durchgeführt. Die Software erzeugt angepasste p-Werte (p.adjust) mit der Benjamini- und Hochberg-Korrekturmethode. Die Konstruktion und Analyse von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken aus Gensätzen wurde in Cytoscape (39) mit dem STRING-Plugin (40) durchgeführt. Cytoscape wurde auch verwendet, um Gemeinsamkeit in den funktionellen Kategorien zu konstruieren und zu visualisieren, die als signifikant angereichert in den Genen identifiziert wurden, die auf die experimentellen Behandlungen reagieren. Um Kategorien zu visualisieren, die aus den D2- oder D3-Behandlungsgruppen identifiziert wurden, aber nicht aus dem Placebo (z.B.Abbildung 4) signifikant angereicherte Kategorien (p.adjust < 0,01) aus allen Gruppen wurden so importiert, dass Behandlungsgruppenknoten (D2, D3 und Placebo (P)) durch Kanten mit den entsprechenden p.adjust-Werten mit funktionellen Kategorieknoten verknüpft sind. Alle Knoten mit einer Kantenverbindung zum Placebo-Behandlungsknoten wurden dann entfernt und die resultierenden Netzwerke weiter gefiltert, um nur die Knoten mit mindestens einer Kantenverbindung mit p.adjust<=0.001 (p.adjust<=0,01 für Reactome-Pfade) zu behalten. Die Ergebnisse wurden schließlich als Heatmap-Diagramme zusammengefasst (Abbildung 4).
Gene Ontology biologischer Prozess (GO BP), Zellkompartiment (GO CC) oder Reacome-Weg-Funktionskategorien, die in den Genprodukten, die durch die Sonden (A) dargestellt werden, signifikant nach unten reguliert sind (adj.P.Val ≤ 0,05) in den D2- oder D3-Behandlungsgruppen der WE-Kohorte, aber nicht in der Placebogruppe, und (B) signifikant hochreguliert (adj.P.Val ≤ 0,05) in den D2- oder D3-Behandlungsgruppen der WE-Kohorte, aber nicht in der Placebogruppe. Genprodukte, die durch die deutlich nach unten regulierten Sonden in den Vergleichen WE D2 V3 v V1, WE D3 V3 v V1 und WE P V3 v V1 vonAbbildung 2Aund mit ENTREZ-Identifikatoren wurden separat einer funktionalen Anreicherungsanalyse mit compareCluster unterzogen (38). Die Details für jede Gruppe sind in der Zusatzdatendatei 4 angegeben. Signifikant angereicherte Kategorien (p.adjust ≤ 0,01) aus allen Gruppen wurden wie im Abschnitt Methoden beschrieben verarbeitet, um Kategorien zu visualisieren, die aus den D2- oder D3-Behandlungsgruppen identifiziert wurden, aber nicht durch das Placebo. Heatmap-Kacheln, die leer sind, entsprechen Kategorien, die die während der Verarbeitung angewendeten Bedeutungskriterien nicht erfüllten. Die vollständigen Netzwerke für jede differenell ausgedrückte Gruppe von Genen sind in der ergänzenden Datendatei 5 dargestellt.
Die gewichtete Gen-Co-Expressions-Netzwerkanalyse wurde in R mit dem WGCNA durchgeführt (41) und CoExpNets (42) Pakete. Eine normalisierte Ausdrucksdatenmatrix, die durch Filtern generiert wurde, um Sonden mit Signalen deutlicher über dem Hintergrund zu halten (30% heller als negative Kontrollsondensignale auf mindestens 41 Arrays), wurde als Eingabe verwendet, bestehend aus 12.169 einzigartigen Sonden. Signierte skalenfreie Netzwerke wurden separat für die Daten für die ethnischen Gruppen SA und WE mit 50 Iterationen der k-means-Clustering-Option in der CoExpNets-Funktion "getDownstreamNetwork" erstellt, um den Clustering-Prozess zu verfeinern (Zusatzdatendatei 6). Pearson-Korrelationen zwischen Clustermodul-Eigengenen und Metadaten für Serum 25(OH)D2, 25(OH)D3, Gesamtkonzentrationen von 25(OH)D und PTH wurden anhand paarweiser vollständiger Beobachtungen berechnet.
Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)
GSEA wurde mit dem R-PaketclusterProfiler (38), die Standardparameter anwenden, die den fgsea-Algorithmus implementieren und mehrere Tests mit der Benjamini- und Hochberg-Methode korrigieren. Gensätze wurden von MSigDB über das msigdbr-Paket erhalten (43). Die Ranglisten der Genlisten für die Befragung wurden aus der LIMMA-Analyse der ungefilterten Microarray-Daten abgeleitet, wobei die Gene nach ihrer t-Statistik vorgeordnet wurden.
Ergebnisse
Die Freiwilligen der Studie waren südasiatische (SA) und weiße europäische (WE) Frauen mit Sitz im Vereinigten Königreich, im Alter zwischen 20 und 64 Jahren [n=335; (28)] und die Teilnahme dauerte 12 Wochen in den Wintermonaten (Oktober bis März, in Surrey, Großbritannien; Breitengrad, 51°14' N). Serummessungen, einschließlich der Konzentrationen von insgesamt 25(OH)D, 25(OH)D2 und 25(OH)D3, wurden aus Nuchtblutproben ermittelt, die zu Beginn [Basislinie definiert als Besuch 1 (V1)] und in den Wochen 6 (V2) und 12 (V3) entnommen wurden. Um festzustellen, ob Veränderungen der Serum-25(OH)D-Konzentration infolge der Vitamin-D-Supplementierung mit physiologischen Veränderungen auf der Ebene der Genexpression verbunden sind, untersuchten wir das Vollbluttranskriptom aus einer repräsentativen Teilmenge der Studienteilnehmer (n=98) mit Gesamt-RNA, die aus V1- und V3-Blutproben isoliert wurde, und Agilent Human Whole Genome 8 × 60K v2 DNA-Mikroarrays (Abbildung 1). Die Teilnehmer der Transkriptomanalyse wurden ausgewählt, um vergleichbare Zahlen zwischen dem Placebo und den beiden Vitamin-D-Behandlungsgruppen zu liefern, die das gesamte Spektrum der Serumreaktionen auf die Supplementierung innerhalb der D2- und D3-Behandlungsgruppen abdecken, wie aus den gemessenen Veränderungen der Serumkonzentration 25(OH)D2 oder 25(OH)D3 zwischen V1 und V3 beurteilt (Ergänzende Datendatei 1).
Metadaten für die Transkriptom-Analyse-Kohorte
Nach der Qualitätskontrolle der Microarray-Daten waren Transkriptomdaten sowohl für die V1- als auch für die V3-Proben von 97 Studienteilnehmern verfügbar (Abbildung 1B); die RNA eines Teilnehmers scheiterte an der Qualitätskontrolle und wurde ausgeschlossen. Ähnlich wie zuvor für die gesamte Studienkohorte gemeldete Daten (28), die Teilmenge der Teilnehmer der vorliegenden Studie zeigte erhöhte Konzentrationen von 25(OH)D2 und 25(OH)D3 erst nach der Supplementierung mit Vitamin D2 bzw. Vitamin D3 und höhere Gesamt 25(OH)D in beiden Behandlungsgruppen (Abbildung 1C). In den Vitamin-D3-Behandlungsgruppen stiegen die mittleren 25(OH)D3-Serumspiegel über die 12-wöchige Intervention um 59% (WE) und 116% (SA). Umgekehrt fielen die mittleren Serumkonzentrationen von 25(OH)D3 in den 12 Wochen der Studie in den Placebogruppen, die kein zusätzliches Vitamin D erhielten; die 25(OH)D3 Baseline-Vitamin-D-Konzentration in der ethnischen Gruppe SA war tendenziell niedriger als in der WE-Gruppe und sank um 23 % bzw. 29 % im Vergleich zum Ausgangswert V1 (Abbildung 1Cund Zusatzdatendatei 1 ). Es ist bemerkenswert, dass in der Vitamin-D2-Behandlungsgruppe die Serumkonzentration von 25(OH)D3 über den Zeitraum von 12 Wochen um 52% (SA) und 53% (WE) stärker zurückging. Serum 25(OH)D2 war in Abwesenheit einer spezifischen Supplementierung niedrig, typischerweise weniger als 5 nmol/L (152/162 analysierte Proben). Die Serumcalciumkonzentration, die entsprechend an die Serumalbuminkonzentration angepasst ist, wurde in allen Stichprobengruppen innerhalb eines normalen klinischen Bereichs gehalten, während die Konzentration des Nebenschilddrüsenhormons (PTH) zwischen V1 und V3 nur innerhalb der SA-Placebogruppe, der WE-Vitamin-D2- und WE-Vitamin-D3-Interventionsgruppe, stabil war. Die PTH-Konzentrationen stiegen bei V3 im Vergleich zu V1 in der WE-Placebogruppe, verringerten sich aber sowohl in der Vitamin-D2- als auch in der D3-Interventionsgruppe in der SA-ethnischen Kohorte.
Auswirkungen der Supplementierung mit Vitamin D2 oder D3 auf die globale Genexpression
Die Filterung der normalisierten Microarray-Daten zur Auswahl von Sonden, die Signale von mindestens 10 % über dem Hintergrund in mindestens 41 (~20 %) der Arrays zeigten, ergab Transkript-Abundanzdaten von 20.662 Sonden, die 17.588 verschiedenen genomischen Merkmalen entsprachen (12.436 von denen mit einem ENTREZ-Genkennung kommentiert wurden). Unter Verwendung der gefilterten Daten identifizierten wir signifikante Unterschiede in den Transkriptionsreaktionen, die über den 12-wöchigen V1- bis V3-Zeitraum der Studie zwischen den Vitamin-D-2, Vitamin-D3- und Placebo-Behandlungsgruppen für jede ethnische Kohorte auftraten. In einer separaten Analyse haben wir signifikante Änderungen innerhalb jeder Gruppe zwischen den Stichprobenpunkten V3 und V1 ermittelt (Abbildung 2und ergänzende Datendatei 2). Ersteres wurde in einer "Differenz-in-Differenz"-Analyse nach der verallgemeinerten Nullhypothese [Behandlung1 getestet. V3 - Behandlung1. V1] - [Behandlung2. V3 - Behandlung2. V1] = 0 (Abbildung 2A, Reihen 7-12), und letzteres mit Behandlung.V3 - Behandlung.V1 = 0 (Abbildung 2A, Reihen 1-6).
(A) Zusammenfassung der Ergebnisse des Limma-Differenzexpressionstests zur Identifizierung signifikanter Veränderungen (adj.P.Val ≤ 0,05) in der Häufigkeit der Transkript-Sonden innerhalb und zwischen den Versuchsgruppen (siehe Ergänzende Datendatei 2 für alle Details). Sowohl die Anzahl der einzigartigen Microarray-Sonden als auch die Anzahl der einzigartigen Genom-Loci, die sie darstellen, werden angegeben. WE = "weiß europäisch"; SA = "Südasiatisch"; D2 = Vitamin-D2-Behandlungsgruppe; D3 = Vitamin-D3-Behandlungsgruppe; P = Placebo-Gruppe.( B) Das CREB1-Gensondensignal unterscheidet sich signifikant (adj.P.Val=0,021) zwischen der mit Vitamin D3 behandelten Gruppe und der Placebogruppe im Laufe des V1- bis V3-Studienzeitraums in der südasiatischen Kohorte (d.h. [SA D3 V3 v V1] v [SA P V3 v V1] Vergleich vonAbbildung 2A). (C) Venn-Diagramme, die die Anzahl der Sonden in der weißen europäischen (WE) Kohorte zeigen, die in V3 im Vergleich zu V1 in jeder Behandlungsgruppe signifikant (adj.P.Val ≤ 0,05) nach unten oder oben reguliert sind. (D) Vergleich der log2-Faltenänderungen (FC) in Hülle und Fülle von V1 zu V3 in der WE-Kohorte in den D2- und D3-Behandlungsgruppen. Sonden, die sowohl in der D2- als auch in der D3-Gruppe deutlich nach oben reguliert sind, aber nicht in der Placebo-Gruppe, sind rot gefärbt, während die ähnlich nach unten regulierten Sonden in blau dargestellt werden (siehe Zusatzdatendatei 3). Eine Sonde, die SEC14L1 erkennt, zeigt die größten Abnahmen der Häufigkeit bei denen, die von D2 und D3 nach unten reguliert werden, aber nicht bei Placebo.
In der "Differenz-in-Differenz"-Analyse für die Daten für die WE-E-Ethnische Gruppe wurden keine signifikanten Änderungen der Sondensignale (adj.P.Val<=0,05) identifiziert, aber fünf wurden in der entsprechenden Analyse der SA-Kohorte gefunden (Abbildung 2A). Darüber hinaus ergab die Differenz-in-Differenz-Analyse der gesamten Studiendaten, ohne die ethnische Zugehörigkeit, keine statistisch signifikanten Veränderungen zwischen den D2- oder D3-Behandlungsgruppen und der Placebo-Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Wir stellen fest, dass eine andere "Differenz-in-Differenz"-Studie über den Einfluss von Vitamin D auf die Genexpression (die BEST-D-Studie) keine signifikanten Veränderungen der Genexpression nach einer langfristigen Vitamin-D-Behandlung in einer kaukasischen Kohorte identifizierte (32). Die beobachtete log2-Faltänderung (log2FC) in der Signalhäufigkeit zwischen V3 und V1 in der Studie fiel in der Regel gut innerhalb von +/- 1, und in einem solchen Kontext ist es wahrscheinlich, dass die in der Studie verwendeten Stichprobengrößen unsere Fähigkeit einschränken, individuelle Genexpressionsreaktionen mit diesem hochkonservativen Ansatz zuverlässig zu identifizieren.
Wir sind der Meinung, dass die starken zwischenmenschlichen Unterschiede in der Genexpression zwischen den Personen in der Studienpopulation wahrscheinlich den Nachweis kleiner statistisch signifikanter Genexpressionsänderungen zwischen den Behandlungsgruppen aus Microarray-abgeleiteten Daten behindern werden. Es ist bekannt, dass die Expression eines bestimmten Gens und sein Ausmaß der Veränderung im Laufe der Zeit je nach Individuum in einer menschlichen Bevölkerung stark variieren können, und die Unterschiede in der Reaktion im Laufe der Zeit innerhalb eines Individuums werden als physiologisch bedeutungsvoller angesehen. Dieses Thema wird in der Diskussion weiter erörtert. In dieser Studie beobachten wir, dass viele statistisch signifikante Unterschiede bei der Bewertung von Genexpressionsänderungen innerhalb eines Individuums im Laufe der Zeit entdeckt werden (wie unten beschrieben, wo wir gepaarte Beobachtungen mit zwei Zeitpunkten pro Subjekt, V1 und V3), untersuchen.
Die fünf signifikanten Veränderungen, die als Reaktion auf die Behandlung der ethnischen Gruppe SA mit Vitamin D3 im Vergleich zum Placebo festgestellt wurden, sind in der ergänzenden Abbildung 1 zusammengefasst. Diese werden in erster Linie durch die deutlichen Veränderungen in der Placebogruppe zwischen den V1- und V3-Probenahmestellen verursacht und können mit den anhaltenden niedrigen Serumkonzentrationen 25(OH)D3 oder hohen PTH verbunden sein, die in dieser Gruppe von Probanden beobachtet werden. Eines dieser unterschiedlich ausgedrückten Gene kodiert das cAMP-Antwortelement-bindende Protein CREB1 (Abbildung 2B), der Teil des cAMP-PKA-CREB-Signalwegs in Knochenzellen ist, der zur Regulierung des Skelettstoffwechsels als Reaktion auf PTH-Konzentrationen beiträgt (44).
Im Gegensatz zur Differenz-in-Differenz-Analyse identifizierten die direkten gruppeninneren Vergleiche der Transkript-Abundanzmessungen bei V3 im Vergleich zu V1 pro Probanden eine große Anzahl signifikanter Veränderungen der Genexpression, insbesondere in den WE D2, WE D3 und WE Placebo-Gruppen (Abbildungen 2A, Cund ergänzende Datendatei 2). Diese statistisch signifikanten Genexpressionsänderungen in der ethnischen WE-Kohorte, die in den Vitamin-D-Behandlungsgruppen auftreten, werden im Folgenden genauer betrachtet. Während es eine gewisse Überschneidung in den Gruppen von differenziell exprimierten Genen gibt, waren nur 13% der nach unten regulierten, differenziell exprimierten Gene (102 von 774) zwischen den beiden Vitamin-D-Behandlungsgruppen üblich. Umgekehrt wurden 28% (216 von 774) und 59% (456 von 774) von D2 bzw. D3 eindeutig nach unten reguliert (mit Ausnahme derjenigen, die in der Placebogruppe zusätzlich nach unten reguliert wurden, gegenüber der entsprechenden 12-wöchigen Intervention).Abbildung 2C). Wie oben erwähnt, sank die Serumkonzentration von 25(OH)D3während des 12-wöchigen Interventionszeitraums in der mit Vitamin D2 behandelten Gruppe; daher könnten Veränderungen der Genexpression, die in dieser Gruppe beobachtet wurden, a priori entweder auf den Einfluss von Vitamin D2 selbst zurückzuführen sein oder auf den Abbau der endogenen 25(OH)D3-Reserven zurückzuführen sein. Es war daher wichtig, eine vergleichende transcriptomische Analyse der Placebo-Gruppe in diese Studie aufgenommen zu haben, um Genexpressionsänderungen, die sich aus Vitamin D2 per se ergeben, von den Veränderungen zu unterscheiden, die aufgrund der Erschöpfung von 25(OH)D3 in der Vitamin-D2-Behandlungsgruppe auftreten.
Es ist bemerkenswert, dass die Expression einer großen Anzahl von Genen zwischen dem ersten und dem letzten Besuch (V1 bis V3) in der nicht behandelten Placebo-Gruppe verändert wurde. Während einige dieser Veränderungen auf die reduzierte Synthese von Vitamin D zurückzuführen sind, die in den nördlichen Breiten in den Wintermonaten zu beobachten ist, gibt es auch eine signifikante Überrepräsentation von Genen, von denen bekannt ist, dass sie saisonale Unterschiede in der Genexpression aufweisen (45) (Zusätzliche Abbildung 2). Es gibt jedoch keine einzigartige Assoziation von saisonal exprimierten Genen mit den Daten für die WE-Placebogruppe; eine ähnliche signifikante Anreicherung in "saisonalen Genen" wird auch für die signifikanten Veränderungen der Genexpression beobachtet, die in den WE D2- und WE D3-Behandlungsgruppen identifiziert wurden (Zusatzabbildung 2), und daher ist es unwahrscheinlich, dass dieser offensichtliche saisonale Effekt ausschließlich Vitamin-D-spezifische Effekte widerspiegelt. Es gab keine Überschneidung zwischen Genen, die ausschließlich in der Placebo-Gruppe signifikant nach unten reguliert wurden, und solchen, die ausschließlich in den Vitamin-D-Behandlungsgruppen (oder umgekehrt) signifikant nach unten reguliert wurden. Im Einklang mit dem 12-wöchigen Zeitraum der Studie sind saisonale Veränderungen der Genexpression daher ein Hintergrundmerkmal aller gesammelten Daten und sind daher ein Faktor, der bei der Durchführung solcher Vitamin-D-Supplementierungsstudien berücksichtigt werden muss.
Die Sonde A_33_P3275751, die die Transkription des SEC14L1-Gens erkannte, zeigte die größte Abnahme der Reaktion auf beide Formen von Vitamin D, aber nicht auf Placebo-Teilnehmer, in der Gruppe der Sondensignale mit signifikant reduzierter Häufigkeit in den V3-Proben im Vergleich zu V1 (Abbildung 2D). Diese Sonde wurde ursprünglich entwickelt, um "Transkriptvariante 7" zu erkennen und zu einer Stelle am 3'-Ende des SEC14L1-Lokus zu hybridisieren, um mehrere Spleißvarianten zu erkennen. Eine hohe Expression von SEC14L1 ist signifikant mit einer lymphovaskulären Invasion bei Brustkrebspatientinnen verbunden, bei der die Transkripthäufigkeit positiv mit einer höhergradigen Lymphknotenmetastasierung und einem schlechten prognostischen Ergebnis korreliert (46). Seine Überexpression ist auch bei Prostatakrebs häufig, wo SEC14L1 als potenzieller Biomarker für das aggressive Fortschreiten der Krankheit identifiziert wurde (47,48).
Gene, die sowohl durch die Vitamine D2 als auch durch Vitamine D3, aber nicht durch Placebo, signifikant nach unten reguliert werden, sind für Funktionen im Zusammenhang mit Immunantworten angereichert
. Angesichts der relativ kleinen Stichprobengrößen, die in dieser Studie verwendet werden, wird es als angemessener angesehen, die Anreicherung der Zellwege unter differenziert exprimierten Genen zu untersuchen, anstatt sich auf Veränderungen einzelner Gene zu konzentrieren. Funktionelle Anreicherungsanalyse der Gene, die durch die Sonden dargestellt werden, die speziell durch die Vitamine D2 und D3 unterdrückt werden (blaue Datenpunkte inAbbildung 2D) deutet darauf hin, dass beide Ergänzungen unterdrückende Auswirkungen auf die Immunantwort in der WE-Gruppe haben (Abbildung 3und ergänzende Datendatei 3). Tatsächlich konzentriert sich ein signifikantes (p = 1,98 × 10−6) Protein-Interaktionsnetzwerk, das aus den in der STRING-Datenbank (49) kuratierten Homo sapiens-Medien-Konfidenzinteraktionen abgeleitet ist, auf eine hoch verbundene Gruppe von Proteinen, die mit der angeborenen Immunantwort, der Neutrophilen-Degranulation und der Leukozytenaktivierung verbunden sind (Abbildung 3A; alle Proteingruppen sind in der ergänzenden Datendatei 3 aufgeführt). Dazu gehört die Histonacetyltransferase, EP300, von der bekannt ist, dass sie als Transkriptionskoaktivator mit VDR, dem Vitamin-D-Rezeptorprotein (50). Insgesamt stimmen diese Ergebnisse mit der sich abzeichnenden Ansicht überein, dass die Vitamin-D-Exposition zu einer Verschiebung von einem entzündungsfördernden zu einem tolerogenen Immunstatus führt (1,2).
Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke für Genprodukte, die den Sonden entsprechen (A) signifikant nach unten reguliert oder (B) signifikant nach oben sowohl in den D2- als auch in den D3-Behandlungsgruppen der WE-Kohorte, aber nicht in der Placebo-Gruppe. Details in der ergänzenden Datendatei 3 angegeben. Die Netzwerke wurden mit der STRING-Datenbank der Homo sapiens Medium Confidence (0,4) Interaktionen generiert, und es werden nur verbundene Knoten angezeigt. Netzwerke für beide (A, B) sind im Vergleich zu randomisierten Sätzen für Interaktionen signifikant angereichert und ergeben p-Werte von 1,98 × 10-6 bzw. 4,99 ×10-9.
Gene, die sowohl durch die Vitamine D2 als auch durch die Vitamine D3, aber nicht durch Placebo, signifikant up-reguliert werden, umfassen Komponenten von Histon H4 und dem Spliceosom
Eine ähnliche Analyse der Sonden, die speziell durch D2 und D3induziert wurden (rote Punkte inAbbildung 2D) erzeugte ein signifikantes (p = 4,99 × 10−9) Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk, das hauptsächlich für mitochondriale und ribosomale Proteine angereichert ist, aber auch zwei Untereinheiten von Histon H4 und SNRPD2 umfasst, eine Kernkomponente des SMN-Sm-Komplexes, die die spliceosomale snRNP-Assembly vermittelt (Abbildung 3B).
Die vergleichende Analyse der funktionellen Anreicherung unterstützt die Rollen der Vitamine D2 und D3 bei der Unterdrückung der Immunität und bei der Chromatin-Modifikation und der Spliceosom-Funktion
Als komplementärer Ansatz zur Analyse der funktionellen Anreicherung bestimmter Untergruppen von Genen, deren Expression durch Supplementierung mit Vitamin D2und D3, aber nicht durch Placebo-Behandlung verändert wird, wurde eine vergleichende Analyse der funktionellen Anreicherung aller signifikanten Änderungen in jeder Behandlungsgruppe durchgeführt (siehe Methoden). Dies zielte darauf ab, funktionelle Kategorien zu identifizieren, die stärker von Vitamin D2 oder Vitamin D3oder von Vitamin D2 und D3 betroffen sind als durch das Placebo, und berücksichtigte die Veränderungen, die in der Placebo-Behandlungsgruppe in den 12 Wochen der Studie auftreten (Abbildung 4und ergänzende Datendatei 4). In Übereinstimmung mit der früheren Analyse sind funktionelle Kategorien, die mit Immunität und Immunantwortwegen verbunden sind, prominent unter den Genen, die durch Vitamin-D-Supplementierung unterdrückt werden (Abbildung 4A), während mitochondriale, ribosomale und spliceosomale Funktionen in den induzierten Genen prominent sind (Abbildung 4B). Obwohl die beiden Vitaminbehandlungen viele gemeinsame Kategorien teilen, die aus dieser Analyse identifiziert wurden, zeigen die Ergebnisse auch einige Unterschiede zwischen den jeweiligen Auswirkungen der D2- oder D3-Supplementierung. Zum Beispiel ist "Histonaustausch" nur in den nach oben regulierten Vitamin-D2-Genen signifikant, und "chromatin-modifizierende Enzyme" sind nur in den D3-Down-regulierten Genen signifikant.
Insgesamt deuten die beobachteten Unterschiede in der Genexpression vom Bluttranskriptom, das in dieser Studie vorgestellt wird, darauf hin, dass die physiologischen Wirkungen von Vitamin D3 und D2 unterschiedlich sein können.
Weighted Gen Correlation Network Analysis (WGCNA) identifiziert Module von Co-Expressed Genen, die signifikant mit Serummarkern der Vitamin-D-Supplementierung in den ethnischen Gruppen WE und SA korrelieren
WGCNA quantifiziert sowohl die Korrelationen zwischen einzelnen Genpaaren oder Sonden in einem Datensatz als auch das Ausmaß, in dem sich diese Sonden die gleichen Nachbarn teilen (41). Der WGCNA-Prozess erstellt ein Dendrogramm, das ähnlich reichliche Sonden in diskrete Zweige gruppiert, und das anschließende Schneiden des Dendrogramms ergibt separate Co-Expressionsmodule, die angegeben ko-regulierte Gensätze darstellen. Die erste Hauptkomponente der Ausdrucksmatrix jedes Moduls definiert das Ausdrucksprofil des Eigengens für das Modul, und dies kann dann mit experimentellen Metadaten korreliert werden. Durch die Zulassung phänotypischer Merkmale, die mit relativ kleinen Anzahl (Zehnen) von Modul-Eigengenen anstelle von Tausenden von einzelnen Variablen (d.h. Gensonden) in Verbindung gebracht werden, lindert WGCNA sowohl das Multiple-Testproblem, das mit der Standard-Differentialexpressionsanalyse verbunden ist, als auch experimentelle Merkmale direkt mit Genexpressionsdaten auf unbeaufsichtigte Weise in Verbindung, die agnostisch des experimentellen Designs ist.
WGCNA wurde verwendet, um separate signierte Co-Expressionsnetzwerke für die ethnischen Gruppen WE und SA zu konstruieren, wie in den Methoden beschrieben, und Pearson-Korrelationen zwischen der Expression der Modul-Eigengene und Serum 25(OH)D2, 25(OH)D3, insgesamt 25(OH)D und Parathyroidhormon (PTH) Konzentrationen wurden berechnet (Abbildung 5und Zusatzdatendateien 6 - 8). Diese Ergebnisse ignorieren daher, ob die Daten aus den Vitamin-D2-D3- oder Placebo-Behandlungsgruppen stammen, und konzentrieren sich ausschließlich auf die Beziehung zwischen den Serummetabolitenkonzentrationen und der Genexpression. Es wurde eine signifikante negative Korrelation zwischen 25 (OH)D2-Konzentrations- und Expressionsmodulen im WE-Co-Expressionsnetzwerk beobachtet, die für immunassoziierte Funktionen angereichert sind (mitternachtsblaue und rosa Module inAbbildung 5A). Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen der verschiedenen analytischen Ansätze (vorgestellt inAbbildungen 3,4). Ebenso ist das einzige Modul mit einer signifikanten positiven Korrelation mit 25(OH)D2 (und Gesamtkonzentration von 25(OH)D), dem roten Expressionsmodul, für GO-Kategorien angereichert, die mit der Ribosom- und mRNA-Verarbeitung verbunden sind (Ergänzende Datendatei 6). In der WE-Kohorte wurden keine signifikanten Korrelationen mit den Serum-25(OH)D3-Konzentrationen festgestellt.
Gen-Co-Expression-Netzwerke für die ethnischen Gruppen WE (A) und SA (B). Für jede Gruppe von Probanden wurden signierte maßstabsfreie Netzwerke aus den Ausdrucksdaten unter Verwendung von WGCNA erstellt, um Sonden mit ähnlichen Ausdruckseigenschaften über alle Proben hinweg in diskrete Module zu gruppieren (Farben auf der y-Achse: Farben in (A, B) sind unabhängig). Die Modulmitgliedschaft für die Module von Genen, die in der WGCNA-Analyse der Daten der südasiatischen und weißen europäischen Kohorten identifiziert wurden, sind in der Zusatzdatendatei 6 detailliert. Die Farbskala rechts von jedem Panel stellt die Pearson-Korrelation (von -1 bis +1) zwischen dem Expressionsprofil für das Eigengen jedes Moduls und den jeweiligen Serum 25(OH)D2, 25(OH)D3, Gesamtkonzentrationen von 25(OH)D und PTH (x-Achse) dar. Die Pearson-Korrelationskoeffizienten werden auch in jedem Feld angegeben, gefolgt in Klammern von einem angepassten p-Wert, der auf die Signifikanz jeder Korrelation testet. Statistisch signifikante Korrelationen (bereinigter p-Wert ≤ 0,05) sind in Rot angegeben. Eine Überschrift signifikante GO-Funktionsanreicherungskategorie (p.adjust ≤ 0,01) für jedes signifikante Modul wird rechts angezeigt; die GO-Testergebnisse für jedes Modul sind in den ergänzenden Datendateien 7, 8 zusammengefasst.
Interessanterweise wurden im Co-Expressionsnetzwerk für die SA-Kohorte stärkere und zahlreichere Korrelationen beobachtet (Abbildung 5B). In Übereinstimmung mit dem WE-Netzwerk ist ein Ausdrucksmodul, das signifikant mit dem Ribosom verbunden ist (schwarzes Modul inAbbildung 5B) zeigte eine allgemeine positive Korrelation mit der Gesamtkonzentration von 25(OH)D, während ein für die Histonbindung (Türkis) angereichertes Modul eine signifikante negative Korrelation mit der 25(OH)D-Konzentration hatte. Auffallenderweise sind Module jedoch für Immunantwortfunktionen angereichert (Mitternachtsblau, Orange, Lila, Gelb inAbbildung 5B) waren konsistent positiv mit den Gesamtkonzentrationen von 25(OH)D und in der Regel 25(OH)D3, aber nicht mit 25(OH)D2-Konzentrationen, im SA-Netzwerk korreliert und negativ mit den PTH-Konzentrationen korreliert. Dies erhöht die Möglichkeit, dass die Vitamin-D-Supplementierung je nach ethnischer Zugehörigkeit des Individuums unterschiedliche Auswirkungen auf das Immunsystem haben kann, darauf hinweisen kann, dass der PTH-Status einen Einfluss auf das Ergebnis hat und physiologische Unterschiede widerspiegeln kann, die sich aus dem niedrigen Vitamin-D-Status bei SA-Frauen ergeben. In diesem Zusammenhang beobachteten wir, dass die PTH-Konzentration am V1-Stichprobenpunkt in der SA-Kohorte im Vergleich zu der WE-Kohorte erhöht war (Abbildung 1C).
Gensätze, die auf Interferon Alpha und Gamma reagieren, zeigen ein divergierendes Verhalten in den Vitamin-D2- und D3-Behandlungsgruppen der WE-Kohorte
Die Markenzeichen-Gensätze der molekularen Signaturdatenbank (MSigDB) stellen kohärente Genexpressionssignaturen dar, die sich auf gut definierte biologische Zustände oder Prozesse beziehen (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Die Gensatzanreicherungsanalyse (GSEA) wurde durchgeführt, um statistisch signifikante (padjust<=0,05), konkordante Veränderungen in der Expression dieser Markenzeichensätze zwischen den V3- und V1-Stichprobenzeiten für die Behandlungsgruppen Placebo, Vitamin D2 und Vitamin D3 zu identifizieren (Abbildung 6und ergänzende Datendatei 9). Interessanterweise zeigten die Gensätze, die die charakteristischen Reaktionen auf Interferon alpha und Gamma definieren, in der WE-Kohorte ein abweichendes Verhalten in den Vitamin-D2- und D3-Behandlungsgruppen. Dies ist offensichtlich als signifikante Aufwärtsregulierung im Laufe der Interventionsstudie in der D3-Gruppe, aber als signifikante Abwärtsregulierung in der D2-Gruppe (siehe auch ergänzende Abbildungen 4, 5, die die Kerngene veranschaulichen, die für die Anreicherungssignale verantwortlich sind). Dies unterschied sich von der SA-Kohorte, in der in der D3-Gruppe eine signifikante Downregulation beobachtet wurde (siehe auch ergänzende Abbildung 6). Es wird anerkannt, dass einige der beobachteten Unterschiede zwischen den WE- und SA-Gruppen die Unterschiede in den jeweiligen Stichprobengrößen widerspiegeln könnten. In Fällen, in denen statistisch signifikante Unterschiede gefunden werden, wie z.B. der gegenseitige Trend in den jeweiligen Interferon-Antworten, sind diese jedoch wahrscheinlich nicht auf Unterschiede in der Stichprobengröße zurückzuführen.
Die Gensatzanreicherungsanalyse mit den MSigDB-Markenzeichen-Gensätzen zeigt ein divergentes Verhalten für die Interferon-Alpha- und Gamma-Antwort-Gensätze nach der Supplementierung mit Vitamin D2 und D3 in der WE-Kohorte an. Farbige Kacheln in der Heatmap entsprechen Gensätzen, die eine statistisch signifikante (Padjust≤ 0,05), konkordante Veränderung zwischen den V3- und V1-Probenahmezeiten für die Behandlungsgruppen Placebo (P), Vitamin D2 (D2) oder Vitamin D3(D3) in den SA- oder WE-Kohorten aufweisen. Graue Fliesen weisen auf Unsignifikanz hin. Ein positiver normalisierter Anreicherungsscore (NES) zeigt die Aufwärtsregulation eines Gens in V3 im Verhältnis zu V1 an, und umgekehrt wird eine Abwärtsregulation durch einen negativen NES-Score angezeigt. Die vollständigen Ergebnisse sind in der ergänzenden Datendatei 9 enthalten, und das Verhalten der führenden Kerngene, die für die signifikanten Anreicherungssignale in den Interferon-Alpha- und Gamma-Antwortsätzen verantwortlich sind, ist in den ergänzenden Abbildungen 4 - 6 dargestellt.
Diskussion
In der vorliegenden Studie führten wir eine longitudinale Bluttranskriptomanalyse in 97 der ursprünglichen Kohorte von 335 Frauen mit zwei ethnischen Hintergründen, Südasien (SA) und weißen Europäern (WE), durch, die von Tripkovic at al (28). Umfangreiche Veränderungen der Genexpression wurden in allen drei Behandlungsgruppen beobachtet, von denen einige einzigartig für die mit Vitamin D2 behandelten oder D3 behandelten Gruppen waren, wobei die Mehrheit eine Downregulation der Transkription über den Zeitraum der 12-wöchigen Interventionszeitraum zeigte. Veränderungen der Genexpression in der Placebogruppe sind wahrscheinlich zumindest teilweise auf saisonale Tropfen des Vitamin-D-Status zurückzuführen (Abbildung 2) (45, 51). Die Auswirkungen der Vitamin-D-Supplementierung auf die Genexpression werden den natürlichen saisonalen Veränderungen überlagert, die ohne Intervention stattgefunden hätten.Abbildung 7präsentiert ein schematisches Diagramm, um das mögliche Zusammenspiel zwischen genetischen Faktoren, saisonalen Veränderungen, Vitamin-D-Status und Vollblut-Transkriptomexpression zu visualisieren.
Ein schematisches Diagramm dieser Studie im Zusammenhang mit genetischen und saisonalen Faktoren, die den physiologischen Vitamin-D-Status und das Ganzbluttranskriptom beeinflussen können. Die Nahrungsergänzung mit Vitamin D2 oder D3 erhöht die nativen Spiegel der aktiven Formen dieser Vitamine im Blut und erzeugt überlappende, aber unterschiedliche Auswirkungen auf die saisonalen Trends in der Genexpression. Nicht-supplementierte Placebo-Probanden bleiben auf ihren natürlichen Trajektorien für die Werte von aktivem D2 und D3 und für ihr saisonales Expressionsprofil. Ausgewählte, differenziell ausgedrückte Wege aus dieser Studie sind im Venn-Diagramm angegeben.
Statistisch signifikante Veränderungen der Genexpression wurden hauptsächlich als Unterschiede innerhalb jeder Behandlungsgruppe festgestellt (d.h. Unterschiede zu Studienbeginn (V1) im Vergleich zu 12 Wochen nach der Intervention (V3) innerhalb jedes einzelnen Teilnehmers). In dieser Hinsicht umgeht unser longitudinales Studiendesign teilweise die Probleme, die oft mit Heterogenität in interindividuellen Reaktionen in omischen Studien von menschlichen Populationen auftreten, die es schwierig machen, robuste Veränderungen zwischen verschiedenen Gruppen von Individuen zu erkennen. Jüngste longitudinale Multi-Omic-Studien zeigen starke zwischenmenschliche Unterschiede zwischen Individuen, die statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Behandlungspopulationen oder zwischen Krankheitsfällen und -kontrollen behindern können [z.B. (52, 53). ; M.P. Snyder, persönliche Kommunikation]. Unsere Strategie, die Veränderungen der Genexpression innerhalb jedes Individuums vom Ausgangswert bis zum Behandlungsendpunkt zu untersuchen, hat es uns ermöglicht, Unterschiede in der Flugbahn und dem Ausmaß der Genexpression zu erkennen und in Kombination mit einer Weganalyse hat es uns ermöglicht, physiologisch aussagekräftige Informationen aus den Transkriptomdaten zu extrahieren; dies hätte nicht durch die Untersuchung der Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen erreicht werden können. Diese In-vivo-Studie zum menschlichen Transkriptom veranschaulicht langfristige Auswirkungen auf die Genexpression. Die Mehrheit der in dieser Studie identifizierten differenziell exprimierten Gene wurde durch Vitamin-D-Supplementierung nach unten reguliert, wobei viele dieser codierten Wege an der Immunität beteiligt waren. Beobachtete Veränderungen der Genexpression stimmen mit Vitamin D überein, das eine modulierende Wirkung auf das Immunsystem ausübt und zu einem tolerogenen Zustand führt, ein Konzept, das von (1) überprüft wurde.
Die Vitamine D2 und D3 haben keinen Einfluss auf die Expression der gleichen Gene im Vollblut
Mit Ausnahme von Genen, die auch über die 12-wöchige Intervention in der Placebogruppe unterschiedlich exprimiert wurden, waren nur 13 % der nach unten regulierten, differenziert exprimierten Gene zwischen den beiden Behandlungsgruppen häufig, während 28 % und 59 % durch die Vitamine D2 bzw. D3 eindeutig nach unten reguliert wurden (Abbildung 2C). Zum Beispiel werden einige biologische Prozesse wie die Histonmodifikation und die kovalente Chromatinmodifikation nur nach der Vitamin-D3-Supplementierung herunterreguliert, während die spliceosomale Funktion nur durch Vitamin D2 hochreguliert wird. Zu den funktionellen Kategorien von Genen, die unter den hochregulierten Genen nach der Supplementierung entweder mit Vitamin D2 oder D3 angereichert sind, gehören die Translations-, mitochondriale und spliceosom-Funktion (Abbildung 3Bund ergänzende Datendatei 4); statistisch angereicherte biologische zelluläre Komponentenbegriffe in diesen funktionellen Kategorien sind ribosomale Proteine, Komponenten der mitochondrialen Atemkette, zwei Untereinheiten der Histon-H4- und snRNP Sm-Proteinkomponenten der Spleißosom-Baugruppe. Es ist bekannt, dass Vitamin D neben der Beeinflussung der Transkription auch posttranskriptionelle Ereignisse beeinflussen kann, indem es Koregulatoren rekrutiert (54). In diesem Zusammenhang ist es relevant, dass Komponenten des Spliceosoms, wie snRNP Sm-Proteine, die sowohl die Transkriptionskontrolle als auch Spleißentscheidungen vermitteln, was zu alternativ gespleißten Transkripten (55) führt, in dieser Studie durch Vitamin-D-Supplementierung hochreguliert wurden.
Angesichts der Erkenntnis, dass die Vitamine D2 und D3 die Expression verschiedener Gene im menschlichen Bluttranskriptom beeinflussen, haben wir kürzlich eine parallele In-vitro-Studie mit einer Modell-Rattenzelllinie durchgeführt (56). Wir untersuchten die jeweiligen Einflüsse der beiden physiologisch aktiven Formen von Vitamin D, 1,25(OH)D3 und 1,25(OH)D2, auf die Differenzierung und die globale Genexpression bei der Differenzierung von CG4-Oligodendrozyten-Vorläuferzellen der Ratte und zeigten erhebliche Unterschiede im Einfluss der beiden Arten von Vitamin D auf die Genexpression nach 24 Stunden und nach 72 Stunden nach Beginn der Differenzierung. Wir zeigten, dass 1,25(OH)D3 und 1,25(OH)D2 die Expression von 1.272 und 574 Genen nach der Zugabe des Vitamins zur Kultur beeinflussten, wobei viele der Expressionsänderungen spezifisch für die eine oder andere Form des Vitamins waren (56). Diese Studie liefert Beweise für die unterschiedlichen direkten Auswirkungen der beiden aktiven Vitamin-D-Metaboliten auf die Genexpression in vitro in kultivierten Zellen und liefert einige Beweise dafür, dass die Veränderungen, die wir in der In-vivo-Studie beobachtet haben, den Einfluss der physiologisch aktiven Formen des Vitamins widerspiegeln können.
Einfluss von Vitamin D auf die Expression von Genen, die für Immunwege kodieren
Gemeinsam mit den D2- und D3-Behandlungsgruppen, aber nicht der Placebo-Gruppe, fanden wir heraus, dass viele verschiedene Wege des Immunsystems durch Vitamin D unterschiedlich exprimiert (weitgehend nach unten reguliert) werden, im Einklang mit der Vorstellung, dass eine physiologische Rolle von Vitamin D darin besteht, die Aktivität des Immunsystems einzudämmen oder auszugleichen (1, 2) (Abbildungen 3A,4und ergänzende Datendateien 3 - 5). Die immunmodulatorischen Wirkungen von Vitamin D sowohl auf die angeborene als auch auf die adaptive Immunität sind gut dokumentiert (57–59). In diesem Zusammenhang ist unsere Beobachtung, dass die Vitamin-D2- und D3-Supplementierung in der WE-Kohorte mit unterschiedlichen Expressionsmustern für Interferon-Alpha (Typ I) und Interferon-Gamma (Typ II)-Signatur-Gensätze verbunden war, als besonders interessant (Abbildung 6). Vitamin D scheint die Aktivität von Typ-Interferon zu modulieren. Zum Beispiel verstärkt es die Auswirkungen der Typ-I-Interferon-Behandlung auf mononukleäre Zellen von Patienten mit Multipler Sklerose (60), was den Beweis für bescheidene Vorteile von Vitamin D als Zusatzbehandlung mit Typ-II-Interferon bei Patienten mit Multipler Sklerose entspricht (61, 62). Vitamin D kann auch helfen, Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus erythematodes (63) zu unterdrücken, die mit einer chronischen Überaktivität der Interferon-Signalisierung und vorläufig bezeichneten Interferonopathien verbunden sind. Darüber hinaus spielen Typ-I-Interferone eine entscheidende Rolle bei der Verteidigung gegen Virusinfektionen. Die Basale Expression von Typ-I-Interferon-stimulierten Genen ist in Abwesenheit einer Infektion der Schlüssel zu einer schnellen und effektiven Reaktion auf eine Virusinfektion (64). Es besteht derzeit ein intensives Interesse an Vitamin D sowohl als potenzielles Prophylaktikum als auch als therapeutisches Mittel zur Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen. Eine der vorgeschlagenen Wirkungsweisen von Vitamin D ist die Modulation der Interferon-Aktivität (65); in diesem Zusammenhang ist unsere Beobachtung, dass Vitamin D3 (aber nicht Vitamin D2) die Expression von Genen verbessert, die an der Interferon-Alpha-Reaktion beteiligt sind, sehr relevant für die Anfälligkeit für Virusinfektionen. Tatsächlich identifizierte eine kürzlich durchgeführte Genom-weite Assoziationsstudie (GWAS) an 2.244 kritisch kranken Covid-19-Patienten genetische Varianten, die zu einer reduzierten Interferon-Typ-I-Signalisierung führen, die mit einer schweren Covid-19-Erkrankung verbunden sind (66).
Genexpressionsänderungen als Reaktion auf Vitamin D sind teilweise auf die Ethnizität zuzuschreiben
Wir haben auch Unterschiede in der Genexpressionsreaktion auf Vitamin D je nach ethnischer Zugehörigkeit gefunden (mit dem Vorbehalt, dass die Stichprobengröße der SA-Gruppe kleiner war als die WE-Gruppe und der durchschnittliche Vitamin-D-Ausgangsstatus im Vergleich zur WE-Gruppe signifikant niedriger war). Im Gegensatz zur weißen europäischen Gruppe wurden Unterschiede in der Genexpression zwischen den Behandlungsgruppen in der südasiatischen Gruppe gefunden (Abbildungen 2A, B), die eine Supplementierung mit Vitamin D3 erhielten, wobei drei Gene nach der 12-wöchigen Intervention im Vergleich zur Placebogruppe signifikant hochreguliert und zwei nach unten reguliert wurden (Abbildung 2und ergänzende Abbildung 1). cAMP-responsives Element-bindendes Protein 1 (CREB1), eines der drei hochregulierten Gene, kodiert einen Transkriptionsfaktor, der als Homodimer an das cAMP-responsive Element bindet. CREB1-Protein wird von mehreren Proteinkinasen phosphoryliert und induziert die Transkription von Genen als Reaktion auf die hormonelle Stimulation des cAMP-Weges. Die Proteinkinase A (PKA)-Wege werden durch das Nebenschilddrüsenhormon PTH als Reaktion auf niedrige Serumcalciumspiegel aktiviert, um die Serumcalcium-Homöostase aufrechtzuerhalten, hauptsächlich durch die Förderung der Vitamin-D 1α-Hydroxylierung in der Niere. Sowohl PTH als auch 1,25 (OH)2 Vitamin D haben ähnliche Wirkungen bei der Förderung der Reifung von Osteozyten und bei der Opposition gegen die Differenzierung von Osteoblasten in Osteozyten (67,68). Es ist relevant zu beachten, dass diejenigen in der SA-Kohorte zu Studienbeginn eine erhöhte Serum-PTH im Vergleich zur WE-Kohorte hatten.
Ethnische Unterschiede in der Reaktion werden auch aus der Weighted Gene Correlation Network Analysis (WGCNA) und der Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) vorgeschlagen, bei denen die Reaktion auf die Vitamin-D3-Aufnahme im Vergleich zur WE-Gruppe die entgegengesetzte Wirkung auf die Interferon-Pathade vom Typ I und II in der SA-Gruppe zu haben schien (Abbildung 6und ergänzende Abbildungen 4, 6). Eine direkte Korrelation zwischen der Stimulation von Immunantworten, mit anderen Interferon-Wegen, mit einem Anstieg der Serum-25(OH)D3-Konzentration war jedoch nur in der SA-Gruppe offensichtlich. Dies ist das Gegenteil von dem, was in der WE-Gruppe beobachtet wurde, wo die Wirkung der Vitamin-D-Supplementierung darin bestand, mehrere Immunwege zu unterdrücken.
Die Transcriptom-Ergebnisse unterscheiden sich erheblich zwischen den beiden verschiedenen ethnischen Gruppen. Während einige der Unterschiede auf Unterschiede in den zwischen den beiden Gruppen untersuchten Stichprobengrößen zurückzuführen sein können, ist es auch möglich, dass einige der Unterschiede echte Unterschiede in den jeweiligen physiologischen Reaktionen der beiden ethnischen Gruppen darstellen. Alternativ können die Unterschiede den physiologischen Ausgangsstatus der SA-Teilnehmergruppe widerspiegeln, die deutlich niedrigere Ausgangskonzentrationen von Vitamin D (und höhere PTH-Konzentrationen) als die WE-Gruppe hatte. Die Bedeutung der Klärung dieser verschiedenen Reaktionen wird durch die sich abzeichnenden Beweise für das Zusammenspiel zwischen Ethnizität, Hautton, Vitamin-D-Status und Anfälligkeit für Virusinfektionen besonders angeregt, wobei Covid-19 hier von besonderer Relevanz ist (12, 13, 69, 70). Die in dieser Studie vorgestellten transkriptomischen Daten könnten einen nützlichen Kontext für weitere Studien bieten, die darauf abzielen, die Rolle von Vitamin D bei der Beeinflussung der Immunantwort auf eine SARS-CoV-2-Infektion zu verstehen, insbesondere in Bezug auf schwere Covid-19. Es ist bemerkenswert, dass die jüngste GenOMICC-Studie zur schweren Covid-19-Erkrankung einen Zusammenhang zwischen schwerer Covid-19 und reduzierter Typ-I-Interferon-Signalisierung (66) hervorgehoben hat. Unsere Feststellung, dass Vitamin D3 die Typ-I-Interferon-Signalisierung zu stimulieren scheint, könnte im Zusammenhang mit seiner Verwendung als prophylaktische Behandlung relevant sein. Es sollte hier beachtet werden, dass, um eine positive Wirkung zu erzielen, vor der Exposition gegenüber dem Virus ein Vitamin-D-Replete-Status erforderlich wäre, der zu einer angeborenen Immunität beiträgt; die Verabreichung von Vitamin D nach der Aufnahme ins Krankenhaus, selbst bei hohen Bolusdosen, würde keinen klinischen Nutzen bringen, da sich das Virus bereits etabliert hätte. Jüngste klinische Studien haben diesen letzteren Punkt bestätigt.
Abschließende Bemerkungen
Unsere Fähigkeit, Unterschiede in den Auswirkungen von Vitamin D2 und Vitamin D3zu erkennen, könnte durch die relativ geringe statistische Macht und durch die Einbeziehung zweier verschiedener ethnischer Gruppen unter den 97 Teilnehmern negativ beeinflusst worden sein, da die Transcriptom-Ergebnisse der beiden ethnischen Gruppen eindeutig unterschiedlich sind; die Anzahl der Teilnehmer stellt eine Schwäche der vorliegenden Studie dar. Es wird wichtig sein, diese Studie mit einer größeren Kohorte zu replizieren, um die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie zu überprüfen oder anderweitig zu überprüfen. Aus den Leistungsberechnungen wird angenommen, dass für eine ganze menschliche Mikroarray-basierte Genexpressionsstudie dieser Art und mit Genexpressionsänderungen der von uns beobachteten Größenordnung mindestens 400 Teilnehmer jeder ethnischen Gruppe für jede Behandlung rekrutiert werden sollten, was einer Gesamtkohortengröße von 2.400 entspricht. In diesem Zusammenhang sollte die biologische Interpretation unserer Ergebnisse als vorläufig angesehen werden und eine unabhängige Überprüfung erfordern. Eine zweite Einschränkung dieser Studie war unser Versäumnis, den Beitrag potenzieller Veränderungen der Blutzellzusammensetzung über die Jahreszeiten und über die ethnische Zugehörigkeit hinweg zu berücksichtigen; es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der Blutzellen im Laufe des Jahres deutlich variieren kann (51,71).
Es ist schwierig, die Ergebnisse der vorliegenden Studie mit anderen gemeldeten In-vivo-Studien zu vergleichen, da die experimentellen Unterschiede im experimentellen Design, einschließlich der Verwendung supraphysiologischer Vitamin-D-Dosen (bis zu 2.000 μg Einzelbolusdosen), verschiedener Arten von menschlichen Populationen und kleiner Stichprobengrößen, die die statistische Analyse nicht machbar machen [z.B. (33,34)]. Darüber hinaus ist unsere Studie insofern einzigartig, als sie die Genexpression bei Teilnehmern mit einer der beiden häufig verwendeten Formen von Vitamin D, Vitamin D2 und Vitamin D3 verglichen hat. Die vorliegende Studie bewertete die allgemeinen Expressionsänderungen in einer komplexen Blutzellpopulation, von der auch bekannt ist, dass sie sich die Zellzusammensetzung über die Jahreszeiten hinweg verändert (51). Darüber hinaus hat sich diese Studie auf die Identifizierung eines statistisch signifikanten Weges oder einer Gensatze, Anreicherung nach anhaltender Vitamin-D-Supplementierung und nicht auf eine genorientierte Analyse konzentriert; der letztere Ansatz ist angesichts der Effektgrößen und des Stichprobenumfangs dieser Studie begrenzt.
Diese Studie legt nahe, dass eine detailliertere Betrachtung der systemweiten Auswirkungen dieser beiden Formen von Vitamin D gerechtfertigt ist. Dies ist vielleicht von besonderer Bedeutung für gefährdete ethnische Gruppen, einschließlich schwarzer und südasiatischer Bevölkerung, die in nördlichen Breitengraden leben. Die Studien müssten zeitlich verlaufsbasiert (zeitlich) sein, um Veränderungen der Genexpression bei Individuen von der Baseline bis zu definierten Probenahmezeiten zu verfolgen, und müssten eine integrierte Kontrolle benötigen, um saisonale Veränderungen der Genexpression zu berücksichtigen. Sie müssten speziell entwickelt werden, um zu beantworten, ob unterschiedliche ethnische Zugehörigkeit oder unterschiedliche Vitamin-D-Ausgangskonzentrationen zu unterschiedlichen Reaktionen auf die Vitamin-D-Supplementierung führen.
Da einige Wege spezifisch durch Vitamin D3 oder in einigen Fällen in entgegengesetzten Richtungen durch Vitamin D3 und D2 reguliert zu werden scheinen, sollten zukünftige Studien untersuchen, ob die Vitamin-D2-Supplementierung einigen der Vorteile von Vitamin D3 für die menschliche Gesundheit entgegenwirken könnte. Diese Möglichkeit wird durch die Ergebnisse dieser Kohorte ausgelöst, dass die zirkulierende Konzentration von 25(OH)D3 innerhalb der mit Vitamin D2 behandelten Teilnehmer nach der 12-wöchigen Intervention signifikant niedriger war als in der Placebo-Gruppe, die keine Vitamin-D-Ergänzungen erhielt - was darauf hindeutet, dass erstere durch die letztere erschöpft sein könnte. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass Richtlinien zur Anreicherung und Nahrungsergänzung mit bestimmten Formen von Vitamin D möglicherweise überarbeitet werden müssen.
Datenverfügbarkeitserklärung
Alle Microarray-Daten sind in der ArrayExpress-Datenbank (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) unter der Beitrittsnummer E-MTAB-8600 verfügbar.
Ethikerklärung
Diese Studie erhielt ethische Genehmigung des National Health Service Research Ethics Committee der Südostküste (Surrey (11/LO/0708) und des Ethikausschusses der University of Surrey (EC/2011/97/FHMS). Alle Teilnehmer gaben vor Beginn der Studienaktivitäten eine schriftliche Einwilligung in Übereinstimmung mit der Helsinki-Erklärung. Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einwilligungserklärung zur Teilnahme an dieser Studie ab.
Beiträge des Autors
CS und SL-N haben die Studie konzipiert. CS, GB und SL-N überwachten das Projekt. LD, GB und LT führten die Experimente durch, AH, GB, CS, LD, CM-L, HW und RE analysierten und interpretierten die Transkriptomdaten. CS, AH und GB schrieben den ersten Entwurf des Manuskripts. AH generierte die Zahlen und alle Autoren trugen zum endgültigen Manuskript bei.
Finanzierung
Diese Arbeit wurde durch den BBSRC (UK) DRINC-Preis BB/I006192/1 an SL-N und CS und durch einen University of Brighton Innovation Seed Fund Award (an CS) finanziert.
Erklärung zu Interessenkonflikten
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Ermangelung kommerzieller oder finanzieller Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Anmerkung des Herausgebers
Alle in diesem Artikel geäußerten Ansprüche sind ausschließlich die der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die ihrer verbundenen Organisationen oder die des Herausgebers, der Redakteure und der Gutachter. Jedes Produkt, das in diesem Artikel bewertet werden kann oder behauptet, dass es von seinem Hersteller hergestellt werden kann, wird vom Herausgeber nicht garantiert oder unterstützt.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich insbesondere bei Michael Chowen CBE DL und Maureen Chowen für ihre großzügige philanthropische Spende (an CS) bedanken.
Ergänzendes Material
Das ergänzende Material für diesen Artikel finden Sie online unter: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.790444/full#supplementary-material
Ergänzende Datendatei 1
Metadaten zu Serumkonzentrationen von 25(OH)D2, 25(OH)D3, insgesamt 25(OH)D, PTH und Kalzium (Albumin-angepasst) für die 97 Probanden, die einer transcriptomischen Analyse unterzogen wurden [ausgewählt aus der von Tripkovic et al. beschriebenen Kohorte (28)].
Ergänzende Datendatei 2
[Hinweis: Die Datendatei ist 9,1 MB groß.] Signifikante Unterschiede in den Transkriptionsantworten, die über den 12-wöchigen V1- bis V3-Zeitraum der Studie zwischen den Vitamin-D-D-2, Vitamin-D3- und Placebo-Behandlungsgruppen für jede ethnische Kohorte auftraten, und signifikante Veränderungen innerhalb jeder Gruppe zwischen den V3- und V1-Ststichprobenstellen (sieheAbbildung 2).
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